NGAL Reference a literatura

Kvantitativní stanovení NGALu v lidské plasmě a moči, validace automatizované turbidimetrie

23 / 05 / 2011 Christensen PH. Holm SS. Kjřller C. Just T. and Heerfordt L., International Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC-World Lab), Berlin

 

Úvod

Ideální biomarker pro diagnostiku akutního selhání ledvin (AKI) by měl dodat časné a přesné informace o závažnosti a rozsahu poškození probíhajícího v ledvinách.

NGAL se v malých koncentracích za normálních okolností vyskytuje v řadě lidských tkání včetně plic, žaludku, tlustém střevu i ledvinách. Renální výskyt NGALu se dramaticky zvýší při poškození ledvin z nejrůznějších příčin a NGAL je vylučován v moči i plasmě. Akutní selhání ledvin je také spjato s narušením činnosti tubulů a glomerulů, což může být detekováno přítomností nízkomolekulárních proteinů (low molecular weight proteins – LMW) jako např. alfa1-mikroglobulin, RBP (retinol vázající protein) v moči a cystatin C v plasmě. NGAL prokázal, že je časným indikátorem pro detekci AKI následující operace srdce, ale v kombinaci se sériovým měřením LWM proteinů v moči a cystatinu C v plasmě se jeho předpovědní potenciál ještě zvýšil (1,2). Ve zmiňované studii byla validována nová rychlá turbidimetrická metoda pro stanovení NGALu.

Metody a materiály

Následující reagencie byly použity:

NGAL Test Reagent kit (ST001RA) byla hotová (ready-to-use) suspenze imunočástic obsahující polystyrenové částice koutované anti-NGAL myší monoklonální protilátkou. Reakční pufr (také neředěný) byl roztok Tris pufru obsahující stabilizátory a konzervanty.

NGAL Test Calibrator Kit (ST002RA) se skládal z pěti různě koncentrovaných roztoků (připravených k použití) rekombinantního lidského NGALu v HEPES pufru.

NGAL Test Control Kit (ST003RA) byl roztok (připravený k použití) nízké a vysoké koncentrace rekombinantního lidského NGALu v HEPES pufru. Všechny reagencie pocházely od Bioporto Diagnostics A/S, Gentofte, Denmark, Distributor: Dako A/S, Glostrup, Denmark.

Reakce mezi protilátkami a NGALem v pacientském vzorku vedou ke tvorbě imunokomplexů. Tento turbidimetrický „end-point“ test používá 3 μL vzorku, 50 µL protilátky a 150 µL reakčního pufru. Změna propouštěného světla byla změřena při 570 nm na automatickém analyzátoru. Celkový testovací čas byl 10 minut.

Validace tohoto testu byla provedena na Hitachi 917, Roche Diagnostics, Manheim, Germany, Příklady z validace na Hitachi 917 viz níže.

Obr. 1. – Typická kalibrační křivka
Koncentrace NGALu ve vzorku byla zjištěna lineární interpolací na 6bodové kalibrační křivce.
Měřený rozsah byl 25–5000 ng/mL.

Typická kalibrační křivka

Výsledky – Přesnost

Močové vzorky s nízkou a vysokou koncentrací NGALu a dvě kontroly byly změřeny v šesti stanoveních ve třech oddělených bězích. Nepřesnost byla spočítána jednocestnou analýzou variance (ANOVA). Výsledky jsou znázorněny v následující tabulce se směrodatnými odchylkami a koeficienty variace (CV). Méně než 5,5 % celkového CV bylo získáno v rozpětí mezi 115 – 2237 ng/mL.

Výsledky – Přesnost

Linearita

Sériové ředění (n=10) pacientských močových vzorků se střední (A) a vysokou (B) NGAL koncentrací: linearita byla přijatelná, pokud ne více než jeden vzorek byl odkloněn o více než 5 % od regresní čáry. Linearita byla celkově dobrá, protože pouze jeden výsledek byl odkloněn o více než 5% od regresní čáry.

Obr. 2 – Linearita
Ředění močových vzorků s 0,9% NaCl. Každý bod byl měřen dvojmo. Linearita testu byla shledána přijatelnou v rozmezí 72 – 4834 ng/mL.

Linearita

Detekční limit

Detekční limit byl stanoven jako nejnižší koncentrace NGALu dávající signál silnější než prázdný vzorek (blank) + 3x směrodatná odchylka. Sériové ředění kalibrátoru 1 (150 ng/mL) s 0,9%NaCl bylo každé měřeno 7-mi stanoveními.

Obr. 3 – Detekční limit
Seriové ředění nejnižšího kalibrátoru (150 ng/mL) s 0,9% NaCl. Detekční limit byl odhadnut na 12 ng/mL.

Detekční limit

Bezpečnostní zóna

Horní limit bezpečnostní zóny byl definován jako koncentrace NGALu v zóně antigenního nadbytku (antigen excess), která dává signál stejný jako nejvyšší standard + 10%. Toto bylo odhadnuto pomocí měření koncentrací NGALu v ředících sériích rekombinantního roztoku s velmi vysokou hodnotou koncentrace NGAL.

Obr. 4 – Odhad Bezpečnostní zóny
Křivka účinnosti dávky (dose-response curve) znázorňuje měřící rozsah a bezpečnostní zónu.
Horní limit bezpečnostní zóny se nachází za hranicí 40000 ng/mL (nejvyšší testovaná koncentrace).

Odhad Bezpečnostní zóny

Porovnání metod

Provedli jsme srovnání metod mezi starším BioPorto ELISA testem a novým, rychlejším turbidimetrickým testem měřeným na Hitachi 917. Obrázek 5 ukazuje korelaci mezi ELISA a Hitachi 917 pro močové vzorky.

Obr. 5 – Porovnání metod
Mezi ELISA a turbidimetrickým testem je vidět dobrá korelace.

Porovnání metod

Závěr

Tento nový turbidimetrický test představuje automatizovanou, rychlou a přesnou metodu stanovení NGALu v moči a EDTA plasmě. Testový set používá reagencie ředěné k přímému použití. Celková nepřesnost při koncentracích NGALu v rozmezí 115 – 2237 ng/mL byla pod 5,5%. Linearita byla vyšetřena s dobrým výsledkem. Detekční limit byl odhadnut na 12 ng/mL. Antigenní nadbytek (antigen excess) nebyl zaznamenán až do koncentrace 40000 ng/mL.

Literatura

  1. Che M., Xie B., Dai H., Qian J., Axelsson J. and Yan Y. Clinical usefulness of novel biomarkers for the detection of acute kidney injury following elective cardiac surgery. Nephron Clin Pract. 2010;115(1):c66-72.
  2. Heise D,, Rentsch K,, Braeuer A,, Friedrich M. and Quintel M. Comparison of urinary neutrophil glucosaminidase-associated lipocalin, cystatin C, and α1- microglobulin for early detection of acute renal injury after cardiac surgery. Eur J Cardiothorac Surg 2010.

Kvantitativní stanovení NGALu v lidské plasmě a moči, validace automatizované turbidimetrie [364 KB]

© 2010, Lab Mark

Webdesign

Giant InteractiveGiant Interactive